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关键词：
啤酒,蛋白质“指纹”技术,啤酒大麦,电泳,品种和纯度鉴定
发表时间：
2012-12-17 08:16:34
摘要 多肽组学(Peptidomics)以其在疾病标志物发现中所起的重要作用正受到越来越多的关注. 然而, 目前尚缺少针对多肽组学的高效定量方法. 本文建立了一种基于纳升液相色谱与四极杆飞行时间质谱联用(μLC-Q-TOF-MS/MS)系统的色谱峰面积无标记多肽定量方法. 该方法首先对两组样品中的多肽进行相对定量, 然后选取相对量大于2 或小于0.5 的多肽, 用纳升液相色谱与串联二级质谱(μLC-MS/MS)的选择性数据依赖模式(DDA)进行序列鉴定. 将不同量标准样品牛血清白蛋白(BSA)酶解液加入到相同量的正常人血清样品中，然后用该方法进行定量分析,得到的定量结果平均相对偏差为6.42%. 该方法分别被用于健康人血清与肝细胞癌(HCC)以及乳腺癌病人血清中内源性多肽的定量比较分析, 并成功鉴定了血清中一些与HCC和乳腺癌相关的内源性多肽. 由于Q-TOF-MS/MS 的高分辨率和宽质量检测范围, 价态高达+5 和分子量超过4000 的多肽也可被可靠地进行定性和定量分析. 实验结果进一步表明在多肽组学分析中μLC-Q-TOF-MS/MS 比传统的MALDI-TOF-MS 具有更高的检测灵敏度.
随着基因组学和蛋白质组学的发展, 目前已经能够对病人进行分子水平的诊断并进行个性化的治
疗，并且在治疗过程中根据其不同的反应而对其进行分类[1~4].多肽在人体生理和病理过程中起着重要的作用, 比如肽类激素, 神经肽, 细胞因子和酶抑制剂等[5]. 为了对这些多肽进行研究, 本世纪初出现了一个新兴学科—多肽组学[6~8]. 它的目标在于发现重大疾病早期诊断的多肽类生物标志物, 如癌症标志物.血液作为人类细胞, 组织和器官之间的主要枢纽, 可能存在着能够预示人体生理和病理变化的多肽类物质[9]. 因此, 简单的血液样品, 如血清和血浆, 被广泛地应用于多肽组学的研究[10~13].
在“鸟枪法”蛋白质组学(shotgun proteomics)中,随着液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)等分析技术的发展, 单次进样分析就能鉴定到成千上万个蛋白质酶解肽段[14, 15]. 然而, 内源性多肽的分析方法相对于“鸟枪法”蛋白质组分析有一些不同, 例如二维凝胶电泳质谱联用技术就不适于分子量小于10 kDa 多肽的分离分析; 在分析蛋白酶解样品时广泛使用的离子阱质谱仪由于分辨率限制, 对高价态内源性多肽的检测有局限性[5]. 因此, 针对生物样品中的多肽物质, 发展出了各种定性和定量的分析方法. 如Petricoin 等人应用表面增强激光解吸离子化-飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)研究了卵巢癌病人血清中多肽和蛋白的降解通路, 并发展出一种用于区分癌症和非癌症的生物信息学工具[16]. 但是, 用于癌症诊断的几个荷质比(m/z) 为534, 989, 2111, 2251 和2465 离子峰在一级质谱不能进行有效的鉴定, 只能采用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间串联质谱(MALDITOF-MS/MS)对内源性多肽进行鉴定并发现了一些潜在的多肽类生物标志物[17, 18].虽然MALDI/SELDI-TOF-MS/MS 能直接用于临床样品的高通量多肽鉴定, 但是该方法受离子化效率, 基质抑制效应以及最佳激光解吸样品点选择的影响, 只能被认为是一种半定量方法[19~21]. 因此, 我们采用同位素标记(iTRAQ)的方法来对MALDI-TOFMS/MS 鉴定到的血浆内源性磷酸肽进行相对定量,证明用iTRAQ 定量磷酸化肽的结果和MALDI 结果基本一致[22].
无标记定量方法也同样被用于多肽组学分析,并且更适合于生物标志物的发现, 因为该方法能够
对任意数目的样品进行定量分析. 相比于各种同位素标记定量方法, 无标记定量方法更加简单廉价, 不同样品中大量多肽的相对变化值通过比较相应多肽的LC-MS/MS 质谱峰离子流峰强度就能够直接得
到[23]. 通常, 该方法需要一套完整的统计方法以及计算软件来对质谱离子流峰进行检测和比较[24~26].Quintana 等人报道了慢性移植肾失功(CAD)病人尿液多肽组无标记定量研究, 并采用虚拟多反应监测(pseudo MRM)对定量结果进行验证[27]. Silva 等采用纳升超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术(μUPLC-Q-TOF-MS)得到高重复的色谱分离和质量分辨率, 这两点对准确定量至关重要[28]. 该方法中质谱采用高低能量交替扫描(MS/MSE)的平行碰撞诱导解离方式, 在μUPLC-MS/MSE 实验中能够给出不同离子更精确的单离子流强度值[29], 而精确质量和保留时间数据对(EMRT)直接反应样品中相应多肽的相对含量. 虽然这种定量策略已经商品化并且成功应用于蛋白酶解多肽的鉴定和定量[30~34], 但对非酶解的内源性多肽却存在无法鉴定的问题(Waters 公司针对MS/MSE 数据的搜库软件不支持非酶切的内源性多肽搜索).
在本工作中, 我们利用介孔硅胶材料MCM-41高度有序孔道结构所具有的体积排阻效应, 选择性
地提取人血清中的低分子量多肽[35, 36]. 随后, 富集到的多肽样品采用μLC-MS/MSE 系统分析并用商品化的PLGS 系统(Waters, USA)对不同样品中的每个EMRT 进行相对定量分析[28]. 最后, 选择相对量大于2 或小于0.5 的EMRT 进行μLC-MS/MS 选择性DDA模式多肽定性, 并通过比较该实验与μLC-MS/MSE 实验所得的质量精度和保留时间的数值对结果进行验证. 将该方法用于标准样品牛血清白蛋白(BSA)的定量分析, 得到平均相对偏差小于10%的定量结果. 随后将该方法用正常人血清和HCC 以及乳腺癌病人血清中内源性多肽的定量比较研究, 并成功鉴定了血清中一些与HCC 和乳腺癌相关的潜在多肽类生物标志物.
疗，并且在治疗过程中根据其不同的反应而对其进行分类[1~4].多肽在人体生理和病理过程中起着重要的作用, 比如肽类激素, 神经肽, 细胞因子和酶抑制剂等[5]. 为了对这些多肽进行研究, 本世纪初出现了一个新兴学科—多肽组学[6~8]. 它的目标在于发现重大疾病早期诊断的多肽类生物标志物, 如癌症标志物.血液作为人类细胞, 组织和器官之间的主要枢纽, 可能存在着能够预示人体生理和病理变化的多肽类物质[9]. 因此, 简单的血液样品, 如血清和血浆, 被广泛地应用于多肽组学的研究[10~13].
在“鸟枪法”蛋白质组学(shotgun proteomics)中,随着液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)等分析技术的发展, 单次进样分析就能鉴定到成千上万个蛋白质酶解肽段[14, 15]. 然而, 内源性多肽的分析方法相对于“鸟枪法”蛋白质组分析有一些不同, 例如二维凝胶电泳质谱联用技术就不适于分子量小于10 kDa 多肽的分离分析; 在分析蛋白酶解样品时广泛使用的离子阱质谱仪由于分辨率限制, 对高价态内源性多肽的检测有局限性[5]. 因此, 针对生物样品中的多肽物质, 发展出了各种定性和定量的分析方法. 如Petricoin 等人应用表面增强激光解吸离子化-飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)研究了卵巢癌病人血清中多肽和蛋白的降解通路, 并发展出一种用于区分癌症和非癌症的生物信息学工具[16]. 但是, 用于癌症诊断的几个荷质比(m/z) 为534, 989, 2111, 2251 和2465 离子峰在一级质谱不能进行有效的鉴定, 只能采用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间串联质谱(MALDITOF-MS/MS)对内源性多肽进行鉴定并发现了一些潜在的多肽类生物标志物[17, 18].虽然MALDI/SELDI-TOF-MS/MS 能直接用于临床样品的高通量多肽鉴定, 但是该方法受离子化效率, 基质抑制效应以及最佳激光解吸样品点选择的影响, 只能被认为是一种半定量方法[19~21]. 因此, 我们采用同位素标记(iTRAQ)的方法来对MALDI-TOFMS/MS 鉴定到的血浆内源性磷酸肽进行相对定量,证明用iTRAQ 定量磷酸化肽的结果和MALDI 结果基本一致[22].
无标记定量方法也同样被用于多肽组学分析,并且更适合于生物标志物的发现, 因为该方法能够
对任意数目的样品进行定量分析. 相比于各种同位素标记定量方法, 无标记定量方法更加简单廉价, 不同样品中大量多肽的相对变化值通过比较相应多肽的LC-MS/MS 质谱峰离子流峰强度就能够直接得
到[23]. 通常, 该方法需要一套完整的统计方法以及计算软件来对质谱离子流峰进行检测和比较[24~26].Quintana 等人报道了慢性移植肾失功(CAD)病人尿液多肽组无标记定量研究, 并采用虚拟多反应监测(pseudo MRM)对定量结果进行验证[27]. Silva 等采用纳升超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术(μUPLC-Q-TOF-MS)得到高重复的色谱分离和质量分辨率, 这两点对准确定量至关重要[28]. 该方法中质谱采用高低能量交替扫描(MS/MSE)的平行碰撞诱导解离方式, 在μUPLC-MS/MSE 实验中能够给出不同离子更精确的单离子流强度值[29], 而精确质量和保留时间数据对(EMRT)直接反应样品中相应多肽的相对含量. 虽然这种定量策略已经商品化并且成功应用于蛋白酶解多肽的鉴定和定量[30~34], 但对非酶解的内源性多肽却存在无法鉴定的问题(Waters 公司针对MS/MSE 数据的搜库软件不支持非酶切的内源性多肽搜索).
在本工作中, 我们利用介孔硅胶材料MCM-41高度有序孔道结构所具有的体积排阻效应, 选择性
地提取人血清中的低分子量多肽[35, 36]. 随后, 富集到的多肽样品采用μLC-MS/MSE 系统分析并用商品化的PLGS 系统(Waters, USA)对不同样品中的每个EMRT 进行相对定量分析[28]. 最后, 选择相对量大于2 或小于0.5 的EMRT 进行μLC-MS/MS 选择性DDA模式多肽定性, 并通过比较该实验与μLC-MS/MSE 实验所得的质量精度和保留时间的数值对结果进行验证. 将该方法用于标准样品牛血清白蛋白(BSA)的定量分析, 得到平均相对偏差小于10%的定量结果. 随后将该方法用正常人血清和HCC 以及乳腺癌病人血清中内源性多肽的定量比较研究, 并成功鉴定了血清中一些与HCC 和乳腺癌相关的潜在多肽类生物标志物.
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