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4cl酶反应体系使用液相检测的一些问题
本人萌新,最近在做4cl家族基因的重组蛋白和五种底物酚酸反应的实验,反应体系中存在0.6mM CoA、5mM ATP、6mM MgCl2、0.2M Tris-Hcl、0.2mM 酚酸底物以及浓度不明的重组蛋白。配制了7种不同PH的Tri... [图片]
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本人萌新,最近在做4cl家族基因的重组蛋白和五种底物酚酸反应的实验,反应体系中存在0.6mM CoA、5mM ATP、6mM MgCl2、0.2M Tris-Hcl、0.2mM 酚酸底物以及浓度不明的重组蛋白。配制了7种不同PH的Tris-Hcl缓冲液(PH=4、5、6、7.1、7.5、8.1、8.9),体系反应10分钟后,沸水煮沸10分钟失活,现使用对香豆酸和酶反应,反应后经12000RAM离心2min后用0.22um过滤头过滤,进样10ul,使用的是XDB-C18的柱子,waters2695的色谱仪,流动相为A1%乙酸和B纯乙腈,洗脱梯度0~5min A:B=95:5,5-35min A:B=25:75,36-5,5min A:B=95:5,56-65min A:B=5:95 进样后发现,除了PH=7.1的样品外其他的样品都没有底物(对-香豆酸)峰,并且所有样品都没有产物(对-香豆酸辅酶A)峰,能请教一下各位大神,怎么解决这个问题
另外还有一个问题,五种酚酸跑混标的时候,芥子酸和阿魏酸总是分不开,大神有没有什么好的方法将他们分开(尽量不使用缓冲液体系作为流动相)
,多谢各位了
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