HPLC产物不出峰，问题在哪？

产物是小分子叶酸（folate,最大吸收波长254、283、363nm）与双亲分子NH2-PEG-DSPE的连接产物，产物的最大吸收波长及吸光系数与叶酸相同。所以我用叶酸做外标来分析产物纯度。柱子是C18，流动相是PBS:甲醇=9:1，...

产物是小分子叶酸（folate,最大吸收波长254、283、363nm）与双亲分子NH2-PEG-DSPE的连接产物，产物的最大吸收波长及吸光系数与叶酸相同。所以我用叶酸做外标来分析产物纯度。

柱子是C18，流动相是PBS:甲醇=9:1，流速1ml/min,阵列检测器扫描220-400这一段波长，叶酸出峰时间7.8min,产物60min都没有峰；我把流动相调整成PBS:甲醇=9:3，叶酸保留时间2.5min,产物60min仍然不出峰。求指导这是怎么回事？另外我第一次进的样如果因为运行时间过短没有冲出来，会不会在后续的进样中冲出来？