液相色谱_串联质谱法测定Beagle犬血浆中黄体酮浓度及其药动学

摘要目的: 建立液相色谱－ 串联质谱法( LC － MS /MS) 测定Beagle 犬血浆中黄体酮含量。方法: 取Beagle 犬血浆样品，加入适量内标( 炔诺酮) ，用液相萃取技术，经超高效液相色谱分离。色谱柱: Agilent ZORBAX － SB C18分析柱( 150 mm × 2. 1 mm，5μm) ; 保护柱: Agilent C18分析柱( 10 mm × 2. 1 mm，5 μm) ; 流动相: 甲醇－ 0. 1%甲酸水溶液( 90∶ 10) ; 流速0. 2 mL·min － 1。采用APCI 离子化－ 串联质谱多离子反应监测( MRM) 模式进行检测，放电电流( NC) = 3. 00，雾化气( GS1) = 30. 00，辅助气( GS2) = 50. 00，气帘气( CUR) = 30. 00，温度( TEM) = 350. 00，碰撞活化裂解( CAD) = Medium( 以上单位均为仪器单位) ，离子选择通道分别为m/z 315. 0 /109. 2( 黄体酮) 和m/z 299. 0 /109. 1( 内标) 。结果: 黄体酮血浆浓度在0. 5 ～ 25 ng·mL － 1 范围内线性关系良好( r = 0. 9991) ，日内和日间精密度试验的RSD 均小于7. 5 %，方法回收率为91. 8% ～ 100. 7%，提取回收率为84. 2% ～ 91. 5%，最低定量限为0. 5 ng·mL － 1 ，最低检测限为0. 2 ng·mL － 1。结论: 该方法专属性强，灵敏度高，准确性好，适用于Beagle 犬血浆中黄体酮含量的测定，可应用于黄体酮制剂生物等效性研究。

    黄体酮( progesterone) 是由卵巢黄体分泌的1 种天然孕激素，与雌激素一起参与下丘脑－ 垂体卵巢轴的调节，精细地介入排卵性月经周期，能促进子宫黏膜的增殖分泌，完成受孕准备，有保胎作用，同时对成年女性因黄体分泌功能不良引起之疾病有一定疗效。常用于月经失调、先兆流产、习惯流产、经前期综合征、功能失调性子宫出血等疾病治疗［1 ～ 4］。另外，牛芝兰等在临床实践中发现黄体酮用于慢性前列腺肥大和慢性宫颈炎，慢性附件炎也有一定疗效［5］。近年
来的深入研究还发现，黄体酮不单只是用于治疗妇产科的疾病，临床上还可用于治疗顽固性腹水、睡眠呼吸暂停综合征、慢性呼吸衰竭、输尿管结石、肾绞痛以及绝经后妇女的骨质疏松症等疾病［6 ～ 11］。
    由于黄体酮在实验动物体内含量很低，均在ng级，采用HPLC 法很难检测其体内浓度，生物样品中黄体酮含量的测定方法以放射免疫法为主，测定时，黄体酮与其代谢物及多种结构相似的甾体激素有交叉免疫反应［12］。液相色谱－ 质谱联用技术( LC －MS) 在选择性、灵敏度、相对分子质量测定和提供结构信息等方面具有明显的优势，能够同时获得可靠的定性定量结果，因而已经被广泛应用于药物在生物体内的吸收、分布和代谢研究( 包括代谢物的结构确定及定量) ［13］。应用HPLC － MS 联用技术可获得复杂混合体中单一成分的质谱图，大大有利于药物，药物代谢物和内源性化合物的分离与鉴定; 药物发生代谢转化后，一般仅在母体药物的结构基础上进行部分结构修饰，因此代谢物与母体药物常有相似的质谱特征离子，据此可对代谢物进行识别，并结合其他碎片特征，对其结构作出合理推断［14］。体内中的黄体酮的测定受5α － 孕烷－ 3， 20 － 二酮、11－ 脱氧皮质酮或17α － 羟孕酮( 17 － OHP) 等不同甾体的影响而发生交叉反应。为了克服这些问题，可以利用HPLC － MS /MS 方法分离这些甾体，对体内的黄体酮药物含量进行评价［15］。
    本文建立的UPLC － Q － TRAP 检测方法具有灵敏度高，专属性强，准确性好的特点。为进一步研究比较黄体酮肌肉注射，口服给药及经皮给药等几种剂型在体内药代动力学参数和进行黄体酮体内吸收评价奠定基础。