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关键词：
离子交换树脂;固体废弃物;表面引发-原子转移自由基聚合;吸附;溶菌酶
发表时间：
2017-02-10 14:36:58
实时荧光聚合酶链式反应偶联高特异性核酸侵入反应检测单核苷酸多态性
杨艳 | -> | 393| 0| 1.781765MB |实时荧光PCR;核酸侵入反应;单核苷酸多态性;乙醛脱氢酶2基因;细胞色素P450 2C19基因
单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括置
换、颠换、缺失和插入。SNP是人类基因组DNA序列中最常见的变异形式，具有数量大、分布广及高度稳定等特点，被认为是决定疾病易感性和药物反应的重要因素。目前，应用于SNP检测的技术有单链构象多态性技术、聚合酶链式反应(PCR)-限制性片段长度多态性技术 , MALDI}VIS技术、焦磷酸测序技术， , Taqma。探针技术等，但是这些技术存在耗时长、操作繁琐、成本高、易污染等缺点。
核酸侵入反应(Invader assay)是一种核酸信号放大检测方法，该方法的检测原理是基于flap核酸内切酶1 (Flap Endonucleasesl, FEN1)能够识别寡核苷酸与目标DNA形成3个碱基的重叠结构，并切割相应的寡核苷酸，将产生的Flaps片段作为识别信号，再通过二次裂解荧光共振转移发卡探针(FRETprobe)等方法进行信号放大检测。与常规基于普通PCR的模板放大技术相比，具有特异性高、不易交叉污染等优点。但是该方法灵敏度较低，通常需要在反应前进行PCR扩增，然后开管加入PCR扩增产物作为核酸侵入反应的模板来提高检测灵敏度，但是开管操作易引起交叉污染。2012年，Zou等将实时荧光PCR和核酸侵入反应进行偶联，建立了实时荧光PCR偶联高特异性核酸侵入反应的方法，并将其应用于大肠癌甲基化的检测，该方法灵敏度高，可定量检测，且不易引起交叉污染。本研究在此基础上将该法应用于SNP的检测，通过对体系中FEN1酶和检测探针用量的优化，降低了背景信号，实现了对SNP的分型检测。
换、颠换、缺失和插入。SNP是人类基因组DNA序列中最常见的变异形式，具有数量大、分布广及高度稳定等特点，被认为是决定疾病易感性和药物反应的重要因素。目前，应用于SNP检测的技术有单链构象多态性技术、聚合酶链式反应(PCR)-限制性片段长度多态性技术 , MALDI}VIS技术、焦磷酸测序技术， , Taqma。探针技术等，但是这些技术存在耗时长、操作繁琐、成本高、易污染等缺点。
核酸侵入反应(Invader assay)是一种核酸信号放大检测方法，该方法的检测原理是基于flap核酸内切酶1 (Flap Endonucleasesl, FEN1)能够识别寡核苷酸与目标DNA形成3个碱基的重叠结构，并切割相应的寡核苷酸，将产生的Flaps片段作为识别信号，再通过二次裂解荧光共振转移发卡探针(FRETprobe)等方法进行信号放大检测。与常规基于普通PCR的模板放大技术相比，具有特异性高、不易交叉污染等优点。但是该方法灵敏度较低，通常需要在反应前进行PCR扩增，然后开管加入PCR扩增产物作为核酸侵入反应的模板来提高检测灵敏度，但是开管操作易引起交叉污染。2012年，Zou等将实时荧光PCR和核酸侵入反应进行偶联，建立了实时荧光PCR偶联高特异性核酸侵入反应的方法，并将其应用于大肠癌甲基化的检测，该方法灵敏度高，可定量检测，且不易引起交叉污染。本研究在此基础上将该法应用于SNP的检测，通过对体系中FEN1酶和检测探针用量的优化，降低了背景信号，实现了对SNP的分型检测。
临床研究表明，硝酸甘油广泛应用于冠心病的治疗，当它进入体内后，经关键酶乙醛脱氢酶2
( Aldehyde dehydrogenase} , ALDH2)作用释放出NO，达到放松血管平滑肌的效果。如果编码该酶的ALDH2基因存在ALDH2 * 2基因多态性，就会影响NO的释放，进而影响治疗效果。除此之外，乙醛脱氢酶2还参与酒精在体内的正常代谢，它能使酒精代谢的中间产物乙醛进一步代谢成无毒产物，而ALDH2* 2基因多态性会使得乙醛在体内累积，损害肝脏、大脑等组织，使患消化道癌症、肝癌、肠癌、乳腺癌等的风险提高氯毗格雷是临床广泛应用的血小板抑制剂，它是前体药物，在体内经过细胞色素P450 2019 ( Cytochrome P450 2019 } CYP2C19 )酶代谢成活性产物而达到抗凝的效果Czo70CYP2C19* 2和CYP2C19* 3基因多态性会使酶的活性下降，造成药物的疗效下降，增加不良心血管事件的概率。因此检测这些基因多态性有利于指导临床合理用药，本研究以ALDH2* 2,CYP2C19* 2和CYP2C19* 3多态性位点为例，使用建立的实时荧光PCR偶联高特异性核酸侵入反应方法对这3个SNP位点进行分型检测。
( Aldehyde dehydrogenase} , ALDH2)作用释放出NO，达到放松血管平滑肌的效果。如果编码该酶的ALDH2基因存在ALDH2 * 2基因多态性，就会影响NO的释放，进而影响治疗效果。除此之外，乙醛脱氢酶2还参与酒精在体内的正常代谢，它能使酒精代谢的中间产物乙醛进一步代谢成无毒产物，而ALDH2* 2基因多态性会使得乙醛在体内累积，损害肝脏、大脑等组织，使患消化道癌症、肝癌、肠癌、乳腺癌等的风险提高氯毗格雷是临床广泛应用的血小板抑制剂，它是前体药物，在体内经过细胞色素P450 2019 ( Cytochrome P450 2019 } CYP2C19 )酶代谢成活性产物而达到抗凝的效果Czo70CYP2C19* 2和CYP2C19* 3基因多态性会使酶的活性下降，造成药物的疗效下降，增加不良心血管事件的概率。因此检测这些基因多态性有利于指导临床合理用药，本研究以ALDH2* 2,CYP2C19* 2和CYP2C19* 3多态性位点为例，使用建立的实时荧光PCR偶联高特异性核酸侵入反应方法对这3个SNP位点进行分型检测。
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