全血改进线性指数聚合酶链式反应用于焦磷酸测序检测基因多态性_项铮

宋丹杨 | -> | 499| 0| 0.841394MB |全血直接扩增;线性指数聚合酶链式反应;焦磷酸测序;基因多态性;酒精代谢

宋丹杨 宋丹杨 | 文档量 |浏览量232106

    随着基因组学及后基因组学的发展,人们意识到基因多态性在阐明疾病的发生和发展、毒物的易感
}h}与耐受性、疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应上都起着重要作用,而单核普酸多态性是目
前最受关注的一类多态性。
    焦磷酸测序技术是通过核普酸和单链模板结合后释放焦磷酸引发酶级联反应,促使荧光素发光并
进行检测的一种核酸测序技术[o -o,用于基因多态性检测[#]、微生物分型[[5]、基因甲基化检测[6]等领
域,尤其是在大规模DNA测序中[[7]的应用,使测序技术发生了革命性变化。但是目前焦测序的单链模
板制备主要采用固相微球法[[A],该方法操作步骤繁琐且效率较低;使用生物素标记引物、链亲和素包被
微球增加了检测的成本;同时,单链制备过程中容易引起样品的交叉污染,以上不足极大地妨碍了焦测
序技术的临床应用[[9]
    为了解决单链模板制备问题,可以采取不对称PCR直接产生单链产物[[I0],但常规不对称PC R方法
扩增单链的效率低,无法得到广泛使用。线性指数PCR ( Linear after}he exponential}olymerase chain
Rreaction} LATE}CR) t"」在不对称PC R的基础上,通过优化引物浓度和兀、值,可获得接近对称PC R
的扩增效率,产生大量单链DNA产物,能够满足基于单链核酸序列的杂交、实时荧光PC R等反应的需
要[o z}。但是LATE }C R引物设计要求严格,且随着PCR的进行,非限制性引物与扩增产物产生竞争,
若扩增片段较长则得到的单链DNA产率会降低。改进的LATE }C R方法(Improved LATE}CR
imLATE}CR) t'3}弥补了LATE }C R的不足,增加非限制性引物长度,减少限制性引物长度,使两者的
戮、差值更大,引物的设计相较于LATE}CR更为宽泛,产生扩增片段长度也更长,扩大了不对称PC R
的实际使用范围。
    为了提高基因检测速度,降低样本污染的可能性,本研究将全血直接扩增和imLATE}CR技术相结
合,建立了基于普通rTaq聚合酶和“高pH缓冲液(HpH Buffer)”的全血imLATE}CR扩增方法。本方
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